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RIP-seq、MeRIP-seq系统阐述KIAA1429肝癌发生调控机理

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RIP-seq、MeRIP-seq系统阐述KIAA1429肝癌发生调控机理

发布日期:2020-04-16 作者: 点击:

RNA的化学修饰是表观调控的一个重要内容,虽然报道RNA存在将近150种修饰,但是 N6-甲基腺苷(m6A)修饰是真核生物中RNA最丰富的修饰类型。

在哺乳动物细胞中,m6A修饰是由m6A writersm6A readersm6A erasers调控的可逆过程。其中m6A writers负责m6A修饰的建立,其中包括了 METTL3METTL14WTAP等。相反,ALKBH5FTO作为m6A erasers,去除m6A修饰。另外,m6A修饰发挥功能需要m6A readersm6A修饰进行识别,包含YTHDF1YTHDF2YTHDF3YTHDC1m6A reads调节修饰RNA的翻译和稳定性。

越来越多的证据表明,m6A修饰对多种生物调控过程有着重要而全面的影响,包括转录剪接、RNA稳定性、翻译效率、胚胎干细胞的维持、细胞命运的决定、T细胞的稳态。对于m6Awriter的挖掘以及作用机制研究一直是当前热点所在。

201912月在Mol Cancer上发表文章KIAA1429 contributes to liver cancer progression through N6-methyladenosine-dependent post-transcriptional modification of GATA3,阐述了肝细胞癌发病中,m6A writer KIAA1429如何通过调控RNAm6A修饰从而发挥作用的。


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一、研究背景



肝细胞癌(Hepatocellular carcinomaHCC)是原发性肝癌最常见的亚型,是全球致死率第三的癌症。肝癌术后复发转移率高,预后差,且治疗手段十分有限。由于肝癌发病机制的分子机制尚未完全阐明,阐明肝癌发生的关键因素将有助于理解肝癌的发病机理并为开发新的有效靶向治疗方法提供依据。

许多研究已经证明了m6A修饰在人类癌症中的关键作用。例如,ALKBH5已经被证明通过去除FOXM1新生转录本甲基化、增强FOXM1的表达来维持胶质母细胞瘤干细胞的致癌性。METTL3被认为是肝癌的致癌因子,它通过抑制SOCS的表达来促进肝癌的发生和转移。据报道m6A writer KIAA1429基因敲除后m6A水平明显降低,且比METTL3METTL14基因敲除后 m6A修饰水平降低更为明显,因此KIAA1429在可能在甲基转移酶中发挥更重要的作用。


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二、研究思路


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三、实验结果



3.1 KIAA1429在肝癌组织中高表且与预后不良相关

为了研究KIAA1429在肝癌中的表达情况,作者首先查询了癌基因组图谱(TCGA)数据库中50对肝癌样本基因表达情况,结果显示,KIAA1429在肝癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。随后, 通过对华西医院70HCC组织qPCR分析,证实KIAA1429HCC组织中的表达与相邻正常组织相比显著上调(图1 a)。此外,免疫组化(IHC)染色和western blot分析进一步证实KIAA1429HCC中上调,这与在mRNA水平上的观察一致。将70例肝癌组织中KIAA1429的表达与临床特征关联分析,发现KIAA1429的高表达与肿瘤大小(P<0.0303)、血清AFPP<0.0157)、微血管侵犯(P<0.0168),TNM时期(P = 0.0220)和BCLC时期(P = 0.0051)有显著相关性。Kaplan-Meier生存分析表明,KIAA1429表达的增加与生存时间段和无病生存率低期相关(图1 bc)。总之,这些结果表明KIAA1429可能与肝癌的进展有关,可能是一个潜在的肝癌预后指标。


3.2 KIAA1429促进肿瘤生长和转移

接下来,作者对7个人类肝癌细胞系中KIAA1429的表达进行检测,其中SK-Hep1HCCLM3显示出较高的KIAA1429表达。为了探讨KIAA1429在细胞生长和转移中的致癌作用,作者构建了KIAA1429基因敲除和沉默细胞系。其中KIAA1429基因敲除显著抑制SK-Hep1HCCLM3的增殖、细胞周期和凋亡抵抗(图.1d-g)。此外,沉默KIAA1429明显降低了SK-Hep1HCCLM3细胞的侵袭和迁移能力(图.1h-i)。

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为进一步研究KIAA1429的体内致癌作用,将感染LV-shKIAA1429和感染LV-shCtrlSK-Hep1HCCLM3细胞接种于裸鼠皮下。与LV shCtrl组相比,LV-shKIAA1429组的肿瘤体积和重量均显著减少(图.2a-b),表明KIAA1429的表达降低有效抑制体内肿瘤生长。随后作者评估了KIAA1429对癌症转移的影响,将感染LV-shKIAA1429LV-shCtrl的细胞移植到裸鼠肝脏,建立肝移植模型,移植6周后,LV-shKIAA1429组肝转移荧光信号强度明显低于LV-shCtrl组(图.2c-d)。HE染色显示,在肝组织切片中,LV-shKIAA1429组的转移灶数量显著减少(图.2e-f),揭示KIAA1429增强了肝癌细胞的肝内转移能力。将荧光素酶标记的细胞注入裸鼠尾静脉,建立肺转移模型,与LV-shCtrl组相比,LV-shKIAA1429组小鼠的发光信号强度显著降低(图.2g-h),肺转移结节的荧光信号强度(图.2i-j)肺组织切片转移灶显著降低(图2.kl)说明KIAA1429可以促进肝癌细胞的肺转移潜能。总之,说明了KIAA1429促进肿瘤生长和转移。

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3.3 RNA-seqMeRIP-seqRIP-seq鉴定GATA3KIAA1429的下游靶点

鉴于KIAA1429m6A writer,作者测定了KIAA1429对肝癌细胞中的m6A修饰调节作用。正如预期,在KIAA1429抑制的SK-Hep1HCCLM3细胞中,m6A水平较低(图.3a-b),证明KIAA1429促进了肝癌细胞中的m6A修饰的建立。随后,为了了解KIAA1429在基因表达方面的调控作用,作者通过RNA-seq比较了对照细胞和KIAA1429敲除细胞之间基因表达。与对照相比,在KIAA1429敲除细胞中,共有448个差异表达基因,GO富集分析显示,这些基因在特异性过程RNA分解代谢过程、RNA代谢过程、RNA转运、RNA定位和翻译、细胞周期、细胞死亡等过程中的显著富集。值得注意的是, KEGG分析表明,各种癌症相关的信号通路受到KIAA1429敲除的影响,证实KIAA1429在促进肝癌进展中发挥作用。

为了阐明基因差异表达是否归因于KIAA1429介导的m6A修饰,作者用MeRIP-seq比较了对照和KIAA1429敲除细胞间m6A整体分布。与先前报道的研究一致,“GGACmotif序列在MeRIP-seq中显著富集(图3c)。m6A peak主要定位于3UTR和接近终止密码子的CDS区域(图3e)。KIAA1429基因敲除细胞中鉴定到了1152个下调差异peak489个上调差异peak(图3d)。由于KIAA1429促进m6A的修饰建立,KIAA1429敲除细胞中1152个下调差异peak受到重点关注。将差异下调peak与差异表达基因关联分析,鉴定到 22个候选基因(图3f),表明敲除KIAA1429可能降低这22个基因转录本的m6A水平,从而导致这些转录本的表达改变。为了进一步证实KIAA1429直接调控作用,采用KIAA1429RIP-seq实验来确定KIAA1429结合的转录本。将RNA-seqRIP-seqMeRIP-seq的联合分析,三者共关联筛选出7个基因(TNFAIP2AKT2GATA3MSANTD3EIF4G1MLPHCEP250)(图3f),说明KIAA1429可能与这7个转录本结合并直接调节它们的m6a水平,导致这些转录本的表达改变。其中,GATA结合蛋白3GATA3)在KIAA1429  RIP-seq中的含量最高,其表达在KIAA1429基因敲除后的变化最为显著(图.3g-h),暗示KIAA429介导的m6a修饰可能主要集中在GATA3转录本上。基于以上证据,作者推测GATA3可能是KIAA1429介导的m6A甲基化的直接下游靶点。

GATA3已经被证明是一个强大的肿瘤抑制基因。因此,作者检测了来自华西医院70个肝癌样本中GATA3的表达水平。结果显示GATA3在肝癌组织中的表达明显低于邻近正常组织(图3i),并且与KIAA1429的表达显著相关(图3j),这意味着KIAA1429GATA3表达具有明显的调节关系。随后,作者通过转染siRNAs或感染慢病毒包装的shRNA来检测GATA3KIAA1429沉默后的RNA和蛋白表达。KIAA1429基因敲除导致GATA3RNA和蛋白质水平上都明显升高(图.3k-p),进一步证明KIAA1429GATA3的直接上游调节因子。

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3.4 GATA3  3UTR参与KIAA1429介导的m6A甲基化

对照组和KIAA1429敲除的MeRIP-seq显示在GATA3 mRNA中发现4m6A峰,包括5UTR上的1个峰、CDS上的1个峰和3UTR上的2个下调差异peak(图4a),并通过MeRIP qPCR进一步验证(图4b)。随后,作者通过MeRIP-qPCR分析GATA3 pre-mRNAGATA3 mRNA,结果显示KIAA1429缺失后两者m6A水平都下降(图4b)。此外,与成熟mRNA相比,GATA3 pre-mRNA m6A水平都较低(图4),表明m6A修饰的GATA3pre-mRNA更容易被降解。因此,作者推断KIAA1429促进了GATA3 3UTRm6A甲基化,然后显著降低了GATA3pre-mRNA的表达。为了验证GATA3  3UTR在其中的重要性,作者构建了含有3UTRCDS-3UTR)和CDSGATA3-CDS表达载体,随后与siRNAs共转染到SK-Hep1HCCLM3细胞中。数据表明,抑制KIAA1429导致了GATA3在转染GATA3 CDS-3UTR载体后显著增加表达,而转染GATA3 CDS后并无该现象(图4c),表明3UTR对于KIAA1429GATA3的调节作用是必不可少的。其次,作者为了评估了m6A修饰对GATA3 3UTR的影响,构建了含GATA3 3UTRpmirGLO-GATA3-WT荧光素酶报告体系,并用胞嘧啶(C)取代m6Amotif的腺苷(A)基序,建立了pmirGLO-GATA3-MUT荧光素酶报告系统。在KIAA1429基因敲除后,pmirGLO-GATA3-WT的荧光素酶活性显著上升(图4d)。相反,pmirGLO-GATA3-MUTKIAA1429沉默没有反应(图4d),这表明GATA3表达的调节是由KIAA1429介导的对GATA3 3UTRm6A修饰控制的。

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3.5  KIAA1429抑制了HuRGATA3pre-mRNA的结合

由于m6A修饰的GATA3 pre-mRNA不稳定,作者研究了在m6A甲基化作用下,哪些分子在GATA3 pre-mRNA的降解中起关键作用。根据之前的报道,RNA结合蛋白HuRpre-mRNA成熟和mRNA稳定性中发挥作用,已被鉴定对无m6A修饰RNA具有稳定的结合能力,因此作者想要探究HuR是否与本实验模型相关。作者首先进行了荧光素酶报告系统分析。抑制HuR后转染pmirGLO-GATA3-WT但不转染pmirGLO-GATA3-MUT的细胞中的荧光素酶活性显著降低(图4e),表明HuR不利于m6A修饰的GATA3UTR稳定。接下来,RIP分析证实了HuRGATA3pre-mRNA之间存在相互作用(图.4f-g)。相反,在HuRRIP产物中没有观察到GATA3 mRNA的显著高浓度。最后,作者检测了转染siRNAsHuR细胞中GATA3GATA3 pre mRNAKIAA1429的表达。GATA3及其pre-mRNAHuR基因敲除后显著下降(图4h)。作者的发现表明,HuR通过与3UTR结合增强GATA3pre-mRNA的稳定性,而KIAA1429抑制了HuRGATA3pre-mRNA的结合。


3.6 GATA3-AS作为引导lncRNA以靶向方式促进KIAA1429GATA3 pre-mRNAm6A修饰 

同一RNA转录本在不同的生理或病理条件下可能显示不同的m6A水平,可能是由于某些顺式或反式因子作用产生的。因此,作者推测可能有一些特定的因素促使KIAA1429对肝癌GATA3pre-mRNA的优先识别。此外,有研究报道,反义转录衍生的长非编码rnalncRNAs)参与了通过顺式调节(cis regulation)影响亲本pre-mRNAs的可遗传性选择性剪接。因此,作者注意到位于10号染色体上的局部lncRNALOC107984204是从GATA3基因的反义链转录而来,并且有653个核苷酸与GATA3pre-mRNA互补,作者称之为GATA3-AS。作者推测GATA3-ASGATA3 pre-mRNAm6A修饰有关

接下来,作者初步分析了来自华西医院临床样本中GATA3pre-mRNAGATA3-AS的表达之间的相关性。结果表明,GATA3-ASGATA3mRNA有一定相关性。亚细胞定位表明GATA3-AS主要定位于细胞核(图.5 GATA3前体mRNA的亚细胞定位一致。更重要的是,GATA3-AS的缺失导致GATA3pre-mRNA的表达显著增强,且GATA3RNA和蛋白质水平上显著升高(图5d5d)。基于以上结果和GATA3-ASGATA3-pre mRNA的序列互补性,可以推断GATA3-AS可能作为一种顺式作用元件参与KIAA1429GATA3-premrna的靶向调控。为了验证这一假设,作者启动了RNA荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光(IF)的联合应用,进一步证实了GATA3-ASKIAA1429的核共定位。此后,RIPqPCR分析表明, GATA3-ASKIAA1429免疫沉淀中有富集(图5e-f)。相反,作者使用以GATA3-AS为靶点的生物素标记寡核苷酸探针进行RNApull down,验证了GATA3-ASKIAA1429之间的相互作用。然而,GATA3-AS显示HuR-RIP中的无,且RNA pull down无法检测到HuR,排除了HuRGATA3-AS结合的可能性。此后,进一步分析以确定GATA3-ASGATA3 pre-mRNA之间的直接相互作用(图5h-i)。总的来说,作者的观察表明GATA3-ASKIAA1429GATA3 pre-mRNA有特异性的相互作用。

为了进一步探讨KIAA1429GATA3 pre-mRNA的特异性选择是否需要GATA3-AS,作者用RIP比较了对照组和GATA3-AS敲除细胞中GATA3 pre-mRNA的富集情况,表明GATA3-AS显著促进了KIAA1429GATA3pre-mRNA之间的相互作用(图5j-k)。与之一致的是,MeRIP qPCR显示抑制GATA3-AS显著降低了GATA3pre-mRNAm6A水平(图5l-m)。抑制GATA3-AS加强了HuRGATA3pre-mRNA的结合(5n-o)并增强pmirGLO-GATA3-WT而非pmirGLO-GATA3-MUT的荧光素酶活性(图5p.)。最后,作者发现GATA3-AS发挥了pKIAA1429GATA3 CDS-3UTRGATA3 CDS单独载体转染的细胞相似的作用(图5q)。综上所述,作者的结果表明,GATA3-AS通过同时与KIAA1429GATA3 pre-mRNA相互作用,引导KIAA1429优先介导GATA3pre-mRNAm6A修饰。

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3.7 GATA3介导KIAA1429GATA3-AS诱导的肿瘤生长和转移

为了确定GATA3是否是KIAA1429GATA3-AS所促进的恶性细胞肿瘤的重要因素,作者评估抑制GATA3是否可以挽救KIAA1429GATA3-AS基因敲除对肝癌细胞发生的影响。作者在GATA3-ASKIAA1429抑制细胞内用siRNAs处理GATA3GATA3的缺失显著逆转了沉默GATA3-ASKIAA1429对体外细胞增殖、抗凋亡、侵袭和迁移的影响(图.6a-f)。随后,进行了进一步的活体挽救实验。稳定的GATA3-ASKIAA1429抑制细胞被LV-shGATA3有效感染。尽管LV-shKIAA1429LV-shGATA3-AS皮下肿瘤的体积和重量显示出显著的减少,但这两组的GATA3抑制恢复了肿瘤生长(图6g-j)。此外,在肺转移模型中,抑制GATA3恢复了小鼠体内发光信号强度(图6k)、肺转移结节荧光信号强度的降低以及由GATA3-ASKIAA1429抑制引起的肺转移灶的减少(图.7a-b)。同样,GATA3基因敲除可恢复由GATA3-ASKIAA1429降低引起的肝内转移潜能受损(图7c-d)。综上所述,GATA3介导KIAA1429GATA3-AS的致癌功能。

最后,作者评估了来自华西医院的70HCC样本的GATA3表达与临床特征之间的关系,这说明GATA3的低表达与微血管侵犯显著相关(P = 0.0168),TNM时期(P = 0.0220)和BCLC时期(P = 0.0220)。此外,GATA3表达降低与总体生存率和无病生存率差有相关性。总的来说,这些发现表明GATA3可以作为肝癌患者预后的一个重要生物标志物。

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总结



总的来说,作者针对m6A writer KIAA1429的作用机理进行了深度的挖掘与阐述。首先通过病例样本间基因的高表与疾病病症之间相关先分析说明了其在肝癌中的重要作用。随后通过构建敲除和沉默材料,进一步证明了其在肝癌发生与转移中的重要作用。随后做了大量工作,阐述了其作用机制。首先从其介导m6A修饰能力入手,通过敲除材料与病变材料之间的MeRIP-seq,寻找下调差异peak,并且结合RNA-seq数据挖掘到调控m6A修饰的基因,进一步利用RIP-seq数据,鉴定到了关键直接作用靶基因GATA3。随后对KIAA1429如何调控GATA3表达进行了探究,确定了其通过m6A修饰的建立影响GATA3 pre-mRNA稳定性从而调控GATA3 表达的作用,并阐述了抑制RNA结合蛋白HuR结合GATA3 pre-mRNA的机理。随后根据已有报道中lncRNA调控m6A靶向建立的机制,对LncRNA -GATA3 AS进行探究,发现GATA3 AS对于作为引导lncRNA以靶向方式促进KIAA1429GATA3 pre-mRNAm6A修饰。左后对GATA3作为关键性靶基因在癌症发生和转移中的作用进行了进一步验证,系统性阐述了KIAA1429对肝癌发生和转移的重要作用。

文章工作量较大,且研究内容较为系统全面,验证之间层层紧扣,并且结合已有报道,对本疾病发生机制进行探究,很好的讲述了KIAA1429作为关键蛋白调控癌症的故事。其中对于靶基因的鉴定部分,利用RIP-seqMeRIP-seqRNA-seq联合分析鉴定靶基因的思路对我们研究m6A动态调控关键蛋白具有重要意义,且该思路也适用于研究RNA结合蛋白的研究。


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